中图分类号：R454.2；R378

抗菌药物耐药性的出现给感染治疗带来巨大挑战。目前，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）对包括万古霉素在内的多种抗菌药物产生了不同程度的耐药，甚至出现了多重耐药，感染后会导致患者住院时间延长以及医疗费用增加^[1]，死亡率比药物敏感者高64%^[2]。同时，通过水平基因转移，大肠杆菌能够获得对多种抗生素的耐药性，包括碳青霉烯类抗生素^[3]。所以，寻找一种安全、高效且不易耐药的抗菌替代疗法迫在眉睫。

抗菌光动力疗法（antimicrobial photodynamic therapy，aPDT）是一种很有前景的抗感染治疗方式。在过去的二十年中，有越来越多的关于光动力疗法治疗细菌感染的报道，特别是多重耐药细菌感染^[4]。aPDT将低强度可见光与无毒光敏剂（photosensitizer，PS）相结合，产生细胞毒性活性氧物质（reactive oxygen species，ROS），能够非特异性破坏微生物的正常结构，因而不会引起细菌耐药，与传统抗生素疗法相比更具有优势^[5]。

aPDT的疗效很大程度上取决于光敏剂的选择。Photofrin（PF）是一种非阳离子血卟啉衍生物，经FDA批准临床上用于各种癌症和癌前病变。同时，PF可以有效地介导革兰氏阳性细菌或真菌的抗菌光动力失活。然而，PF介导的aPDT对革兰氏阴性菌效果较差，碘化钾（potassium iodide，KI）的加入使其杀菌效果显著提高^[6]。目前，PF介导的aPDT在MRSA和大肠杆菌方面的研究较少，因此，本研究以MRSA和大肠杆菌为实验对象，探究PF联合KI介导的aPDT对MRSA和大肠杆菌的体外杀伤效果，为之后的动物实验研究提供数据支持。

1 材料和方法

1.1 材料 

1.1.1实验对象

大肠杆菌标准菌株K-12（ATCC 33780）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌USA300由Manassas公司提供。

1.1.2主要试剂

Photofrin（PF）、碘化钾（potassium iodide，KI）、脑心浸出液肉汤（Brain heart infusion broth，BHI）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS，pH=7. 4）。

1.1.3主要仪器

蓝光光源为Omnilux Clear-U型发光二极管（波长415±15 nm，功率0~1.5 W）、功率计（功率密度12~16 mW/cm²）。

1.2 方法 

1.2.1制备菌悬液

分别取MRSA（USA300）和大肠杆菌（ATCC 33780）单菌落到 BHI溶液，在振荡培养箱（37 ℃、120 rpm）培养过夜，离心后用BHI重悬培养2～3小时至对数生长期，通过分光光度计（600 nm波长）测定吸光度值（Optical density，OD），当OD值为0.6时，经培养可知菌悬液浓度为10⁸ 菌落数（Colony forming units，CFU）/ml，将对数期菌悬液用PBS洗涤离心2次，制备成10⁸ CFU/ml菌悬液。

1.2.2 PF介导的aPDT对MRSA和大肠杆菌的杀伤作用

分别以MRSA和大肠杆菌为实验对象，分为aPDT组、单纯光敏剂组、单纯光照组和空白对照组。在aPDT组中，取1 ml PF（MRSA组的PF终浓度为0.01、0.1、0.5和1 μM ，大肠杆菌组PF终浓度为1、10、50和100 μM）与1 ml 菌悬液混匀（终菌落数10⁸ CFU/ml），室温避光孵育30 min，分别取200 μL菌液到96孔板中给予10 J/cm²光照；单纯光敏剂组：取1 ml菌液和1 ml PF混匀，室温避光孵育30 min；单纯光照组：取1 ml菌液和1 ml PBS混匀后光照；空白对照组：取1 ml菌液和1 ml PBS混匀，无光敏剂，不光照。

为计算细菌存活率，用PBS将各组菌液稀释成初始菌浓度的10^1-5倍，分别取10 μL接种于BHI琼脂板（37 ℃，避光培养12～24 h），观察统计菌落数并计算细菌存活率，存活率=（各组菌落数÷空白对照组菌落数）×100%。以上每组实验重复3次，每次设立3个平行对照。当细菌存活率下降大于99.9%为有效杀菌，下降大于99.999%为高效杀菌^[7]。

1.2.3 KI联合PF介导的aPDT对MRSA和大肠杆菌的杀伤效果  

实验分为KI + PF-aPDT抗MRSA组（A组）、KI + PF-aPDT抗大肠杆菌组（A0组）、MRSA对照组（B组）、大肠杆菌对照组（B0组）四大组。根据KI终浓度1、10、25、50和100 mM，依次分为A1～A5组和A01～A05组，蓝光光照均为10 J/cm²，A组PF终浓度为0.5 μM，A0组PF终浓度为10 μM，即每组取1 ml菌液与1 ml PF避光孵育30 min，再加入1 ml不同浓度的KI后，取200 μL混合液加至96孔板中进行光照。对照组分为：（1）PF-aPDT组（B1组、B01组），加入菌液和PF各1 ml混匀避光孵育30 min，再加入1 ml PBS混匀后光照；（2）暗对照组（B2组、B02组），仅加入菌液、PF和100 mM KI，不进行光照；（3）KI光照组（B3组、B03组），取菌液、PBS和KI各1 ml 混匀后光照；（4）空白对照组（B4组、B04组），取1 ml菌液和2 ml PBS混匀。每组实验重复3次。各组统计CFU及存活率的处理同方法1.2.2。

1.3  统计学方法

使用统计软件SPSS26.0分析CFU及细菌存活率，采用单因素方差分析对计量资料作统计学分析，采用LSD-t检验进行多组间两两比较，当P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PF介导的aPDT对MRSA和大肠杆菌的杀伤作用

光能量密度均为10 J/cm²，当PF浓度分别为0.01、0.1和0.5 μM 时，PF介导的aPDT抗MRSA细菌存活率分别为84.8889%、15.3166%、0.3762%，与空白对照组（存活率100%）比较差异有统计学意义（P<0.05），但MRSA存活率下降<99.9%，未达到有效杀菌；当PF浓度为1 μM时，MRSA存活率为0.000 2%，即下降99.999 8%，与空白对照组存活率相比差异有统计学意义（P<0.001），达到高效杀菌，见图1。当PF浓度为1和10 μM时，大肠杆菌存活率分别为99.371 1%、98.564 0%，与空白对照组存活率相比，差异没有统计学意义（P>0.05）；当PF浓度为50和100 μM时，大肠杆菌存活率分别为92.861 8%、87.484 9%，与空白对照组存活率相比差异有统计学意义（P<0.05），但未实现有效杀菌，见图2。单纯光敏剂组、单纯光照组与空白对照组存活率之间相比差异均无统计学意义（P>0.05）。

图1  10 J/cm²蓝光照射下不同浓度PF介导的aPDT对MRSA的抗菌作用

注：## 表示存活率下降>99.999%，达到高效杀菌

图2  10 J/cm²蓝光照射下不同浓度PF介导的aPDT对大肠杆菌的抗菌作用

2.2 KI联合PF介导的aPDT对MRSA和大肠杆菌的杀伤作用

光能量密度均为10 J/cm²，MRSA组在0.5 μM PF的情况下，B1组存活率下降99.608 8%。在加入1、10和25 mM KI的情况下，A1～A3组存活率分别下降了99.690 8%、99.794 0%、99.853 8%，同B1组相比差异无统计学意义（P>0.05）。在加入50和100 mM KI的情况下，A4和A5组存活率分别下降99.999 2%、99.999 8%，同B1组相比差异有统计学意义（P<0.01），见图3。光能量密度均为10 J/cm²，大肠杆菌组在PF浓度为10 μM的情况下，B01组存活率下降1.693 6%。在加入1 mM KI的情况下，A01组存活率下降0.609 4%，同B01组相比差异无统计学意义（P>0.05）。在加入10和25 mM KI的情况下，A02和A03组存活率分别下降8.506 0%、93.284 6%，同B01组相比差异有统计学意义（P<0.01），但未实现有效杀菌。在加入50和100 mM KI的情况下，A04和A05组存活率均下降99.999 9%，同B01组相比差异有显著意义（P<0.001），见图4。暗对照组、KI光照组与空白对照组相比差异均无统计学意义（P>0.05）。

图3  10 J/cm²蓝光照射下不同浓度KI联合0.5 μM PF介导的aPDT对MRSA的抗菌作用

注：**表示与B1组比较，P<0.01

图4  10 J/cm²蓝光照射下不同浓度KI联合10 μM PF介导的aPDT对大肠杆菌的抗菌作用

注：***表示与B01组比较，P<0.001

3 讨论

无毒的PS被适当的光源激活后与分子氧相互作用产生ROS，诱导微生物细胞失活^[8]。基态PS吸收光子激发到单重态，经电子跃迁至三重态，I型机制中和底物反应发生电子转移生成ROS，如超氧阴离子、羟基自由基（HO^·）和过氧化氢（H₂O₂）等，II型机制中能量可以直接传递给分子氧产生单线态氧（¹O₂）。HO^·和¹O₂都属于活性氧物质，可以损伤几乎所有类型的生物分子（蛋白质、脂质和核酸）并杀死细胞^[9]。

Huang等^[10]探索了Cu-Cy NPs对革兰氏阳性菌（MRSA和粪肠球菌）和革兰氏阴性菌（大肠杆菌和鲍曼不动杆菌）的灭活作用，发现Cu-Cy NPS介导的aPDT能有效杀灭革兰氏阳性菌MRSA，但对革兰氏阴性菌大肠杆菌无效。本实验中，在蓝光光能量密度为10 J/cm²和1 μM PF的情况下，aPDT可以使MRSA存活率下降99.999 8%，实现高效杀菌；在100 μM PF的情况下，大肠杆菌存活率下降12.515 1%，未实现有效杀菌，与以往研究结果相一致，其原因可能是PF为中性或略带阴离子性质，可以较好地与MRSA外膜相结合，而无法附着在大肠杆菌的外膜上。革兰氏阳性细菌细胞壁的多孔性允许各种颗粒或自由基穿透细胞^[11]，因而更容易受到胞外产生的单线态氧的影响。就大肠杆菌而言，PF无法轻易进入细胞内，导致光动力生成的ROS同样不能到达杀伤靶位，因此无法取得理想的杀菌效果。

当PS没有一个明显的阳离子电荷时，它通常对革兰氏阴性细菌显示非常低的抗菌活性^[12]。PF介导的aPDT可以抑制大肠杆菌的生长，但不能达到杀菌效果。如果为了达到更强的抗菌效果而不断增加光敏剂的浓度和光能量密度，那么可能会对周围组织产生不良影响。因此，人们进行了广泛的尝试以提高aPDT效率，在aPDT过程中加入无毒的无机盐就是其中之一^[13]。KI是目前临床研究较多的一种可以增强某些PS介导aPDT抗菌效果的无机盐。越来越多的实验研究表明，无毒KI溶液与亚甲基蓝或孟加拉玫瑰红混合后再经光照射，比单独使用光敏剂对微生物的杀灭效果更好^[14]。本研究发现50 mM KI联合0.5 μM PF，aPDT后MRSA存活率下降99. 999 2%，当50 mM KI联合10 μM PF，aPDT后大肠杆菌存活率下降99.999 9%，均实现高效杀菌，即KI可以显著增强PF-aPDT对上述两种细菌的抗菌作用。

综上所述，KI的加入可显著增强PF介导的aPDT对MRSA和大肠杆菌的杀菌效果。在50 mM KI联合0.5 μM PF的情况下，aPDT可实现对MRSA的高效杀菌，50 mM KI联合10 μM PF抗大肠杆菌也可达到高效杀菌效果。本实验为体外研究，可为aPDT的体内实验及临床研究起到一定的参考作用。

参考文献

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