基金项目：济宁市重点研发计划 （医学研究和临床医学类） 项目编号：2023YXNS212

子宫内膜癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤，近年来发病率和死亡率上升，当前治疗方法虽有一定效果，但早期诊断和有效治疗仍面临困难[1]。探寻新的诊断和治疗靶点成为肿瘤研究的关键方向。PAX基因家族在多种肿瘤发生发展中作用显著，其异常甲基化与肿瘤密切相关[2]。甲基化能调控基因表达，影响肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，5-aza-dC可调控肿瘤细胞功能。然而，PAX基因甲基化与子宫内膜癌发生发展的研究较少[3]。本研究检测PAX基因启动子区域甲基化水平，探究其在子宫内膜癌发生发展中的作用，分析其对癌细胞生物学行为的影响，验证其作为潜在治疗靶点的可能性，为子宫内膜癌的诊疗提供新策略[4]。

 1. 资料与方法  

1.1一般资料

选取2022年1月至2024年6月收治的120例子宫内膜癌患者和120例健康女性作为正常对照组。患者年龄35 - 70岁，平均（52.34±6.58）岁，BMI均值（23.12±2.12）kg/m²；对照组年龄30 - 65岁，平均（48.56±5.72）岁，BMI均值（23.08±2.07）kg/m²。两组一般资料无显著差异（P > 0.05），具有可比性。纳入标准：研究组为该时段确诊的子宫内膜癌女性；对照组为无生殖系统疾病的健康女性；研究对象年龄30 - 70岁；均签署知情同意书；研究组未接受过放、化、内分泌治疗。排除标准：患有严重重要器官疾病；有其他恶性肿瘤病史或正在接受相关治疗；处于妊娠或哺乳期；近三个月接受过激素类治疗；无法提供有效知情同意书。  

1.2研究方法

组织样本采集后速冻于液氮，转至 -80℃冰箱保存。实验前取出，生理盐水清洗、剪碎，加裂解液冰上匀浆，按DNA提取试剂盒说明提取DNA。

1. DNA提取与甲基化检测：用QIAamp DNA Mini Kit提取基因组DNA，严格按试剂盒步骤操作：组织剪碎加裂解缓冲液和蛋白酶K，56°C孵育过夜；加乙醇调节酸碱度，12000 rpm离心1分钟使DNA吸附于硅胶膜；用缓冲液AW1、AW2洗涤，洗脱缓冲液AE洗脱， -20°C保存。用NanoDrop 2000测DNA浓度和纯度，确保A260/A280比值在1.8 - 2.0。采用亚硫酸盐测序法（BSP）测PAX基因甲基化水平：取1μg DNA加CT Conversion Reagent，50°C孵育16小时；纯化DNA后用特异性引物PCR扩增；产物电泳、回收、连接至pMD18 - T载体，转化至DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选，挑取白色菌落培养；提取质粒DNA测序，用Sequencher软件分析，计算甲基化程度。

 2. 细胞实验方法：选用HEC - 1A和Ishikawa细胞系（购自CCTCC），在含10%胎牛血清、双抗的RPMI - 1640培养基中，37°C、5% CO₂培养箱培养，2 - 3天传代。 - 转染处理：用Lipofectamine 3000转染试剂转染PAX基因过表达质粒、5 - aza - dC及阴性对照。转染前一天，细胞接种至6孔板，转染时融合度70% - 80%。按说明书混合转染物，室温孵育5 - 10分钟形成复合物，加入培养基，培养4 - 6小时后换新鲜培养基，继续培养24 - 48小时。设置1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L的5 - aza - dC处理组与对照组（0 μmol/L），处理后进行细胞实验。 - CCK - 8法测细胞增殖能力：转染细胞以5×10³个/孔接种到96孔板，每组5个复孔。分别在培养0h、24h、48h、72h时加10 μl CCK - 8溶液，孵育1 - 2小时，酶标仪测450 nm波长吸光度，绘制生长曲线。 - Transwell小室法测细胞侵袭和迁移能力：侵袭实验时，Matrigel基质胶稀释后加至Transwell小室上室，37°C孵育30分钟形成基质膜；转染细胞重悬至1×10⁵/ml，取100 μl加入上室，下室加含20% FBS培养基，培养24 - 48小时。结束后擦去上室未穿膜细胞，固定、染色下室细胞，显微镜计数。迁移实验步骤类似，上室不铺基质胶，培养12 - 24小时后计数。  

1.3观察指标

检测并比较子宫内膜癌患者癌组织、癌旁正常组织和正常对照组子宫内膜组织中PAX基因启动子区域甲基化水平；观察5 - aza - dC处理后Ishikawa和HEC - 1A细胞增殖、侵袭和迁移能力变化；用Western blot和实时荧光定量PCR检测PAX基因甲基化对相关蛋白和基因表达的影响。  1.4统计学处理计量资料以均数 ± 标准差（x±s）表示，两组比较用独立样本t检验，多组比较用单因素方差分析（One - way ANOVA），两两比较用LSD法；计数资料以率（%）表示，组间比较用χ²检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1不同区域PAX 基因甲基化水平对比

子宫内膜癌患者癌组织中 PAX 基因启动子区域的甲基化水平显著高于癌旁正常组织和正常对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。癌旁正常组织中 PAX 基因启动子区域的甲基化水平与正常对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 1。

表1不同区域PAX 基因甲基化水平对比

2.2 细胞实验结果对比

CCK-8 法检测结果显示，随着 5-aza-dC 浓度的增加，子宫内膜癌细胞系 Ishikawa 和 HEC-1A 的增殖能力逐渐增强。与对照组（0μmol/L 5-aza-dC）比较，1、5、10μmol/L 5-aza-dC 处理组细胞的增殖能力显著增强（P < 0.05）。见表 2。

表2 细胞实验结果对比

注：与对照组比较，P < 0.05

2.3Transwell 小室法检测结果对比

Transwell 小室法检测结果显示，随着 5-aza-dC 浓度的增加，子宫内膜癌细胞系 Ishikawa 和 HEC-1A 的侵袭和迁移能力逐渐增强。与对照组（0μmol/L 5-aza-dC）比较，1、5、10μmol/L 5-aza-dC 处理组细胞的侵袭和迁移能力显著增强（P < 0.05）。见表 3。

表3Transwell 小室法检测结果对比

注：与对照组比较，P < 0.05

2.4相关蛋白与基因表达结果

Western blot 法检测结果显示，与对照组（0μmol/L 5-aza-dC）比较，1、5、10μmol/L 5-aza-dC 处理组子宫内膜癌细胞系 Ishikawa 和 HEC-1A 中 PAX 基因的蛋白表达水平显著升高（P < 0.05）。实时荧光定量 PCR 法检测结果显示，与对照组（0μmol/L 5-aza-dC）比较，1、5、10μmol/L 5-aza-dC 处理组子宫内膜癌细胞系 Ishikawa 和 HEC-1A 中 PAX 基因的 mRNA 表达水平显著升高（P < 0.05）。见表 4。

表4相关蛋白与基因表达结果

注：与对照组比较，P < 0.05

 讨论

本研究探讨了PAX基因甲基化在子宫内膜癌发生中的关键作用，揭示了PAX基因甲基化对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响，并进一步分析了PAX基因通过PI3K/AKT信号通路可能调控细胞行为的潜在机制。研究结果表明，PAX基因启动子区域的甲基化水平在子宫内膜癌患者的癌组织中显著高于癌旁正常组织及正常对照组，并且降低甲基化水平可显著增强癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力。这些发现为本次研究进一步理解子宫内膜癌的分子机制提供了重要的实验数据，并为临床诊断和治疗提供了潜在靶点^[9-10]。

本研究探究了PAX基因甲基化在子宫内膜癌发生中的作用、对癌细胞生物学行为的影响及潜在调控机制。结果显示，子宫内膜癌患者癌组织中PAX基因启动子区域甲基化水平显著高于癌旁正常组织和正常对照组，降低甲基化水平可增强癌细胞增殖、侵袭和迁移能力，为理解子宫内膜癌分子机制和临床诊疗提供依据[9-10]。 PAX基因家族在肿瘤发生中作用关键，异常甲基化致基因表达沉默，影响肿瘤细胞行为^[11]。在子宫内膜癌中，PAX基因甲基化抑制其正常表达，促进癌细胞恶性行为，可能是重要分子标志物和治疗靶点^[12]。5-aza-dC处理实验表明，其能去甲基化PAX基因启动子区域，恢复表达，促进肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移，进一步证实PAX基因的关键作用^[13]。临床资料显示，PAX基因甲基化可能通过影响PI3K/AKT信号通路调控细胞行为^[14]。该通路在肿瘤发生、发展和转移中作用重要，激活促进肿瘤细胞增殖、迁移，抑制则阻碍肿瘤细胞生长。本实验表明，降低PAX基因甲基化水平可促进癌细胞恶性行为，且可能通过调节PI3K/AKT信号通路增强细胞恶性表型^[15]。

综上所述，PAX基因的甲基化在子宫内膜癌的发生和发展中起着关键作用，通过降低PAX基因的甲基化水平能够显著增强子宫内膜癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，且PAX基因甲基化可能通过调控PI3K/AKT信号通路来影响细胞的生物学行为。因此，PAX基因甲基化不仅为子宫内膜癌的分子机制提供了新的见解，还为该疾病的诊断和治疗提供了潜在靶点。未来的研究可以通过检测PI3K/AKT信号通路的相关分子，进一步探索PAX基因甲基化与PI3K/AKT信号通路之间的关系，为揭示其潜在机制提供更多证据。

参考文献：

[1]王芬芬, 谢幸. 子宫内膜癌的病因及高危因素[J]. 实用妇产科杂志, 2020, 36(6): 401-403.

[2]张赫, 孔为民. 代谢因素与子宫内膜不典型增生及子宫内膜癌的相关性列线图模型[J]. 肿瘤学杂志, 2021, 27(7): 566-571.

[3]戴一博, 王婧元, 赵路阳, 等. 子宫内膜癌 DNA 错配修复基因异常的相关研究进展[J]. 中华妇产科杂志, 2019, 54(12): 869-872.

[4]PULVERER W, KRUUSMAA K, SCHÖNTHALERS S, et al. Multiplexed DNA methylation analysis in colorectal cancer using liquid biopsy and its diagnostic and predictive value[J]. Curr Issues Mol Biol, 2021, 43(3): 1419-1435.

[5]周琦, 吴小华, 刘继红, 等. 子宫内膜癌诊断与治疗指南(第四版)[J]. 中国实用妇科与产科杂志, 2018, 34(8): 880-886.

[6]XIES S, ZHANG Y, PENG T, et al. TMEFF2 promoter hypermethylation is an unfavorable prognostic marker in gliomas[J]. Cancer Cell Int, 2021, 21(1): 148.

[7]MASOOD M, GRIMM S, EL-BAHRAWY M. TMEFF2: a transmembrane proteoglycan with multifaceted actions in cancer and disease[J]. Cancers(Basel), 2020, 12(12): 3862.

[8]GURRIERI L, DE CARLO E, GERRATANA L, et al. MGMT pyrosequencing-based Cut-off methylation level and clinical outcome in patients with glioblastoma multiforme[J]. Future Oncol, 2018, 14(8): 699-707.

[9]DANKOVÁ Z, BRANYD D, DVORSKÁ D, et al. Methylation status of KLF4 and HS3ST2 genes as predictors of endometrial cancer and hyperplastic endometrial lesions[J]. Int J Mol Med, 2018, 42(6): 3318-3328.

[10]王鹏, 赵建国, 刘静. TMEFF2在子宫内膜癌组织中表达和甲基化水平的变化及与患者病理特征的关系[J]. 医学信息, 2021, 34(15): 54-59.

[11]杨凤泊, 赵丽君, 徐游贵, 等. 子宫内膜癌组织错配修复基因 MMR表达及其临床意义[J]. 现代妇产科进展, 2020, 29(2): 120-124.

[12]范宇, 王南, 高原, 等. 基于 DNA 甲基化的散发性子宫内膜癌生物学标志物 的 荟 萃 分析[J]. 海南医学, 2020, 31(3): 379-388.

[13]邓波儿, 孔为民. 子宫内膜癌的表观遗传学研究进展[J]. 国际肿瘤学杂志, 2021, 48(3): 184-188.

[14]赵湘铃, 段朝晖, 张敏, 等. 中国子宫内膜癌疾病负担状况及流行趋势预测[J]. 中国慢性病预防与控制, 2023, 31(8): 568-573.

[15]Crosbie EJ, Kitson SJ, McAlpine JN, et al. Endometrial cancer[J]. Lancet, 2022, 399(10333): 1412-1428.