感染是急危重症患者死亡的主要原因之一，以下呼吸道感染为例，其发病率在全球感染性疾病位居榜首，是全球患者死亡的首要原因之一^[1] ，预估中国每年新发下呼吸道感染患者约1000万/年^{[2, 3]}。肺炎是成年人患病和死亡的主要原因，导致美国每年超过一百万人的住院率和较高的重症监护病房入院率。其中包括社区获得性肺炎（community acquired pneumonia, CAP）,这是一种由肺实质病变引起的呼吸道感染，发生在医院之外，与全世界的高发病率和高死亡率有关。

CAP大大降低了全世界的预期寿命，是一项重大的临床及经济负担。尽管在预防、病原学诊断和抗特定病原治疗方面得到了很大的改善，但是由于耐药菌、难治性病原体的增加以及出现新的病原体，CAP依然是全球感染性疾病的主要死因。早期、准确测定CAP感染的病原学对于实现有效的精准治疗显得至关重要，但是由于目前病原微生物检测灵敏度、检测速度及可获得的病原微生物范围的局限性，往往很难实现。我们前期已探讨了宏基因组二代测序（mNGS）在重症社区获得性肺炎（severe community acquired pneumonia, SCAP）患者的临床评估及其危险因素的识别，因此，本节从CAP的流行病学、最常见的病原体和目前可用的诊断方法等方面，介绍对引起CAP的病原体的诊断研究现状。

1、 CAP的发病特点

在中国，脓毒血症患者占重症监护病房患者的20%，90天死亡率高达35.5%，其中最常见的感染为SCAP（68.2%），其重症监护病房幸存者的长期发病率也很高。据国外研究报道，成人CAP在全球常见疾病中具有较高患病率和病死率，每年可夺去约 300万人的生命，也是全球十大死亡原因之一。在欧洲和北美成人 CAP的发病率从每年每千人5例到11例不等，在美国为每千人每年2.5例，并随着年龄的增长而增加。老年人和免疫力低下者的 CAP 死亡率要高得多，据报道死亡率为 20-40%，而一般人群的死亡率为6-10%。此外，耐多药菌在65岁及以上人群中的发病率较高，这与他们更频繁地使用医疗系统和累积暴露于多种抗生素有关。因此，依据年龄、基础病和季节等的不同，CAP表现出不同的发病特点。例如婴儿肺炎、老年人肺炎以及与流感相关的病毒性肺炎。引起发病的病原体种类也多种多样，包括细菌、非典型病原体和病毒，它们的毒力和耐药性情况在不同地区差别也很大，并随着时间的推移而变化。

2、CAP的常见病原谱

已知CAP是由多种呼吸道病原体引起的，如病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体和寄生虫，可能是单独或混合感染。常见病毒包括呼吸道合胞病毒、流感病毒、人副流感病毒、人腺病毒、人肠道病毒/鼻病毒、人冠状病毒和人偏肺病毒；而肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和嗜肺军团菌是常见的呼吸道细菌。CAP诊断和治疗指南表明，导致我国发病的最主要病原体是肺炎支原体和肺炎链球菌,其次是流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌和衣原体等。但是在全国范围内关于病原体分布的数据也并不一致。此外，由于社会、经济、环境和人口因素的影响，CAP的病因学在地理上存在差异。美国疾病控制与预防中心（center for disease control and prevention，CDC）社区肺炎病原学电子隐私信息中心（ electronic privacy information center,EPIC）研究，2259例住院成人CAP患者测得病原体中病毒占23%，细菌11%，其中肺炎链球菌仅占5%。欧洲2005—2012年报道肺炎链球菌仍是最常见病原体，但从12.0%至85.0%不等。亚洲（不含中东）1990—2012年间58篇CAP病原学英文文献系统综述亦表明肺炎链球菌仍然最常见，但仅占13.3%。日本24%，韩国和中国台湾地区14%，菲律宾12%，泰国、中国大陆地区和印度8%-9%，马来西亚和新加坡4%-5%。我国21世纪初北京和上海的两项较大样本成人CAP病原学前瞻性多中心研究，均显示肺炎链球菌居第二位（首位肺炎支原体），分别占10.3%和12.0%。同时，有研究表明流感病毒、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体和鼻病毒被认为是CAP的主要病原体。这可以解释为，由于检测技术的进步和对非典型病原体认识的提高，在CAP中检测到的非典型病原体（支原体、衣原体）的比例正在增加。近几年来，由于人口老龄化、免疫力低下的带菌者增多以及病原体的发展，革兰氏阴性菌（如肺炎双球菌等）已成为 CAP 的主要病因之一。刘向欣等人发现，唐山市CAP的病原体主要为革兰氏阴性杆菌，其中肺炎链球菌是主要致病菌，其次为肺炎链球菌、鲍曼不动杆菌和大肠杆菌。此外，肺炎克雷伯菌被确定为中国急性呼吸道感染的第四大常见病原体。我们前期研究也证明鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯杆菌是SCAP患者最常见的致病菌,同时也是其危险因素之一。如上反映了病原菌的地区及时间分布差异。

4、CAP的现有的病原微生物诊断方法

4.1传统检测手段

为了确诊，临床上依赖多种传统检测方法，包括呼吸道标本涂片染色、细菌真菌培养、血清学反应、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）、（1,3）-β-D 葡聚糖试验（(1,3)-β-D dextran test，G 实验）、半乳甘露聚糖试验（galactomannan test, GM实验）等。其中，痰培养作为最常用的病原菌检测手段，但是阳性检出率普遍低于 40%，且对病毒、寄生虫、支原体、衣原体等非典型病原菌的检测较为困难。血清学检查虽然具有检测速度快的优点，但其敏感性及特异性较低。PCR 生物技术只能检测和扩增出已知的脱氧核糖核酸 (DNA)片段，无法检测或识别未知的 DNA或核糖核酸 (RNA)病原体。G试验和GM试验仅对部分真菌感染有一定的提示意义，而且无法明确病原菌种属。如上所述，由于传统方法检测的低敏感性和时效性较长，培养往往需要48到72小时的长潜伏期才能提供可操作的结果，但阳性率仅为10%左右，除此之外，对于混合感染和未知致病微生物的检测是传统检测方法无法逾越的障碍。因此传统检测虽然提供了相当经济有效且快速的方法，但是只限于诊断已知的最常见的感染。而且它们常常不能定义致病微生物(尽管进行了系统的检查，高达60%的病例对临床医生没有提供具体的指导)，大约只能在38%的社区获得性肺炎成人患者中检测到病原体，而且通过血清学和PCR检测到的微生物数量有限。宏基因组测序(metagenomics next generation sequence，mNGS)的进展为克服这些诊断挑战带来了希望，通过提供的微升临床样本中无需培养的微生物基因组评估就能够在数小时之内获得病原学结果。

4.2mNGS技术的概述

高通量测序（NGS）是20世纪90年代在第一代Sanger测序技术发展的基础上提出的一种分析方法。mNGS 应用最先进的基因组学技术，对临床诊断复杂的传染病进行快速病原体诊断，直接分析自然状态下的微生物有机群落，无需在实验室分离单个菌株。mNGS可以同时检测病原体、气道微生物组和宿主免疫应答的转录生物标志物，从而扩展宿主基因表达分析和当前基于微生物的诊断方法。

4.3mNGS技术的优点及缺点

（1）mNGS做为一个潜在的光谱病原体检测工具，检出率更高且在病原体检测和多微生物感染诊断方面表现良好。一项针对CAP患者的临床研究表明，85%的患者通过mNGS在肺泡灌洗液BALF样本中被确定为病原体阳性，相比之下，传统检测方法仅证实50%的患者为病原体阳性。mNGS结果显示病原菌种类繁多，有研究报道，通过传统的方法在37%的CAP患者中发现了细菌。而在我们前期研究中，mNGS的细菌阳性率为75.95%，并且结果包括34种细菌、6种病毒、5种真菌等。同时Xie等报道了mNGS在CAP病原体检测中应用的回顾性研究，发现CAP患者中病毒(15.4%)、鲍曼不动杆菌(12.3%)、真菌(11.8%)是最丰富的菌种。

（2）mNGS可以检测出许多传统微生物培养无法检测到的病原体。呼吸道病毒在CAP中起着越来越重要的作用，这有效弥补了传统检测方法对未知病毒的局限性，其应用提高了病毒检测的灵敏度。Haibing Liu等人的研究通过mNGS可以得出疱疹病毒是住院CAP患者中检测到的主要病毒。在COVID-19大流行的初期阶段，mNGS为致病性病毒提供了快速和准确的识别。在确定病原体前的广谱抗生素使用时，mNGS可以作为传统方法的有效补充，进一步提高CAP病原体诊断的效率，优化治疗。

（3）结核分枝杆菌感染在中国有很高的流行率。结核分枝杆菌培养周期长，大多数种类的非结核分枝杆菌培养困难，因此，mNGS可能是一种有效的方法来鉴定分枝杆菌由于其优越的敏感性。值得注意的是，我们前期研究mNGS漏掉2例Xpert检测阳性的结核分枝杆菌病例，这可能是由于mNGS没有包括一个可以帮助更彻底地打破分枝杆菌的细胞壁珠击步骤。因此同时使用mNGS和气管抽吸物结核杆菌Xpert检测方法，在一定程度上以最大限度地恢复病原体并提高诊断的准确性。

。5、结语与展望

尽管抗特定病原菌治疗有了很大的进步，但 CAP依然是感染性疾病致死率高的一个主要原因。与许多传统检测方法相比，mNGS不仅对临床感染中常见的病原体具有高灵敏度，而且在诊断罕见的非典型病原体和交叉感染方面也具有独特的优势，同时是显著提升临床病原体检出率、促进早期准确治疗的发展、降低发病率、避免并发症和改善预后的重要一步。因此，mNGS可能是临床CAP精准诊断和靶向治疗的重要检测技术，并对患者的早期识别和风险评估具有重要意义。但在面对临床上的复杂且危重的CAP患者时，mNGS的检测结果需要与患者的临床表现、影像学检查和实验室检验等多方面的诊断信息综合评估，可以和传统的病原学检测互为补充，以便尽快做出最贴近临床实际的判断，从而最大限度地改善患者的预后，并确保患者从中受益。

参考文献：

 [1] El B C, Mokdad A H, Dwyer-Lindgren L, et al. Trends and Patterns of Differences in Infectious Disease Mortality Among US Counties, 1980-2014[J]. JAMA, 2018,319(12):1248-1260.

 [2] Christopher Troeger B F B I. Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries, 1990-2016: a  systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016[J]. Lancet Infect Dis, 2018,18(11):1191-1210.

 [3] Cookson W, Cox M J, Moffatt M F. New opportunities for managing acute and chronic lung infections[J]. Nat Rev Microbiol, 2018,16(2):111-120.

[项目基金]：自治区“天山英才”医药卫生高层次人才培养计划（领军人才）（TSYC202301A026）