项目基金：安徽高校自然科学研究项目基于隧道势垒间跳跃机理的羧基碳纳米管/聚乙二醇复合导电薄膜的合成与气敏特性研究”（2022AH052359）

安徽省2022年度质量工程“增材制造产业产教融合实训基地”（2022cjrh012）；
安徽省2023年度质量工程“产教融合”背景下高职院校增材制造技术专业素养与能力本位教育融合研究与实践（2023jyxm1332）

一、引言

自从1991年碳纳米管（CNTs）被发现以来，其独特的物理和化学性质使其在生物医学、电子学、材料科学等领域展现出巨大的应用潜力。然而，随着CNTs在生物医学领域研究的深入，其潜在的生物毒性问题也逐渐受到关注。特别是多壁碳纳米管（MWCNTs），由于具有较强的生物相容性，其安全性受到了更多的关注。本研究选用羧基化多壁碳纳米管（MWCNTs-COOH）为研究对象，探讨其在体外环境下诱发的氧化应激效应与机理，以期为碳纳米管的生物安全性评价提供科学依据。

二、材料与方法

2.1 材料

本实验选用的材料是高质量的羧基化多壁碳纳米管（MWCNTs-COOH），其纯度超过95%，由西安齐岳生物科技有限公司，一家在纳米材料领域享有盛誉的供应商提供。MWCNTs-COOH因其独特的化学结构和物理特性，如优异的电导率、高比表面积和良好的生物相容性，使其在众多科研领域中备受青睐。在实验开始前，对MWCNTs-COOH进行了严格的表征分析，以确保其在后续实验中的可靠性和一致性。

通过红外光谱分析，我们详细研究了MWCNTs-COOH的官能团分布，尤其是羧基的引入情况，这是其生物活性和生物相容性的重要影响因素。高分辨率的透射电子显微镜（HRTEM）被用于观察其微观结构，包括管径、壁厚以及可能存在的缺陷，这些参数直接影响MWCNTs-COOH的分散性能和细胞毒性。此外，分散性测试通过分散剂的优化选择和处理条件的设定，确保了MWCNTs-COOH在水溶液中的均匀分散，避免了团聚现象，从而保证了实验结果的准确性。

在确保了MWCNTs-COOH的纯度、结构完整性和良好的分散性后，我们进一步对其在细胞培养环境中的行为进行了预实验，以评估其可能对细胞的影响。这一系列的前期工作，旨在为后续探究MWCNTs-COOH在体外环境下的生物效应及其机制奠定坚实的基础。

2.2 方法

（1）采用尖端的高级透射电子显微镜（HRTEM），如同一位微观世界的侦探，我们细致入微地探索了MWCNTs-COOH的微观宇宙。每一纳米管的直径，如同精细编织的丝线，分布均匀且规律，揭示了其独特的物理特性。壁厚的测量，一丝不苟，如同在微观尺度上的建筑学研究，展示了材料的坚固与稳定。而那些微小的缺陷结构，犹如地图上的标记，指示着纳米管的生长历程和潜在性能。通过高分辨率红外光谱（HR-IR），我们如同聆听宇宙的低语，解码了表面羧基官能团的密度，它们的化学信息如同一首无声的交响乐，诉说着MWCNTs-COOH的化学性质。

进一步，拉曼光谱的灵敏感应，如同艺术家的细腻笔触，描绘出材料的内在和谐，验证了其结构的完整性。X射线光电子能谱（XPS）则如同科学家的精确天平，精确称量出每一个元素的贡献，构建出MWCNTs-COOH的元素组成全景图。这些尖端技术的联合作用，如同一曲和谐的科学协奏曲，共同为我们揭开了MWCNTs-COOH神秘面纱的一角。

（2）运用尖端的等温滴定量热法（ITC），仿佛科学家们在微观世界中进行一场精准的芭蕾，每一滴溶液的加入都蕴含着信息的密码，微妙地揭示了MWCNTs-COOH与生物体内至关重要的酶，如谷胱甘肽-S-转移酶（GST）和超氧化物歧化酶（SOD）的亲和力。每一次的热响应，如同一束微光，照亮了它们相互作用的深邃角落，揭示出结合热力学参数背后的生命秘密。而圆二色谱（CD）光谱，则像一个色彩斑斓的解码器，解读着酶分子在MWCNTs-COOH影响下构象的微妙转变，那些曲线的起伏，如同乐谱上跳跃的音符，诉说着生物活性的波动。

在计算的王国里，分子动力学模拟成为探索的利剑，科学家们如同魔术师，操纵着电子和原子，构建出MWCNTs-COOH与酶的动态交锋场景。他们深入微观世界，观察着每一次碰撞、每一次旋转，揭示出可能的结合模式，仿佛在绘制一幅精细的三维画卷，让无形的相互作用变得可见，为理解这种纳米材料如何微妙地干预生物过程提供了至关重要的洞察。

（3）利用尖端的Muse智能触控细胞分析仪，科学家们展开了一场精密的细胞生命观察。在时间的脉络中，他们追踪着每一刻的微妙变化，将MWCNTs-COOH对原代小鼠肝细胞的触碰，以细腻的时序画卷呈现。每一次剂量的增减，都是一次生死的微妙较量，细胞的存活率在数字中起伏，如同心跳的节奏，揭示着纳米材料的生物影响。

流式细胞仪如同夜空中的星辰，捕捉并分析着细胞的轨迹，寻找那些因MWCNTs-COOH暴露而闪烁的异常光点。在实时荧光定量PCR的舞台上，CAT、SOD基因的表达如同音符，随着暴露的旋律起舞，它们的增减透露着细胞内部氧化还原状态的微妙失衡。MDA的生成速率，就像一串无声的警告，警示着细胞膜的损伤与氧化压力的累积。

进一步，细胞周期的分析如同揭示生命的秘密密码，MWCNTs-COOH可能正在悄然调整细胞的生命周期，诱导的凋亡现象如同细胞的哀歌，唤起对纳米安全性的深思。每一个数据点，每一段曲线，都是科学家们对生命奥秘的敬畏与探索，也是他们向未知挑战的坚定步伐。

三、结果与讨论

3.1 MWCNTs-COOH的表征

在全面剖析MWCNTs-COOH的特性时，红外光谱分析揭示了一系列特征吸收峰，这些峰对应于羧基官能团的特征振动，从而确证了COOH基团成功地与MWCNTs的碳壁结合。高分辨率透射电子显微镜（HR-TEM）的高清晰度图像揭示了MWCNTs-COOH的精细微观结构，其多壁结构层次分明，展现出纳米管的优良分散性和尺寸一致性。管壁厚度控制得当，无显著的缺陷或外来杂质，显示出优异的结构完整性。

这些表征数据不仅验证了MWCNTs-COOH的高纯度，而且为其在生物医学应用中的潜在安全性提供了初步证据。其均匀的表面官能团化可能有助于降低生物系统的免疫反应，提高生物相容性。纳米管的均匀分散性可能有利于药物或生物分子的负载，从而在药物输送系统中发挥作用。

为了进一步深化理解，我们将借助拉曼光谱，利用其对碳纳米材料结构敏感的特性，来探测MWCNTs-COOH的晶体质量、缺陷密度和官能团分布。X射线光电子能谱（XPS）将用于精确测定表面元素的化学状态，以揭示可能的化学键合环境，这对于理解MWCNTs-COOH与生物分子间的相互作用至关重要。

将通过同步辐射X射线衍射（SR-XRD）和原子力显微镜（AFM）等高级技术，深入研究MWCNTs-COOH的结晶度和表面粗糙度，这些因素将直接影响其生物界面行为。通过这些综合的表征手段，我们将全面揭示MWCNTs-COOH的物理和化学特性，为设计和优化其在生物医学领域的应用提供坚实的理论基础，如生物传感器、生物标记物和组织工程支架等。

在未来的实验中，我们还将探讨MWCNTs-COOH在生理条件下的稳定性，通过动态光散射（DLS）和zeta电位测量，研究其在生物流体中的长期行为。这些研究将有助于我们理解MWCNTs-COOH在复杂生物环境中的行为，为其实现安全有效的生物应用提供关键信息。

3.2 MWCNTs-COOH与酶的相互作用

ITC（Isothermal Titration Calorimetry）和光谱学实验提供了深入洞察MWCNTs-COOH与两种关键生物酶相互作用的详细信息。这些实验揭示，MWCNTs-COOH与这两种酶之间的结合力虽然微弱，但呈现出显著的疏水性相互作用特征，这可能源于MWCNTs-COOH表面的羧基团与酶分子表面疏水区域的相互作用。这种弱相互作用模式暗示，MWCNTs-COOH在生物系统中可能通过非共价相互作用与酶短暂接触，而不形成稳定的复合物。

进一步的光谱分析，如圆二色谱（CD）和荧光光谱，揭示了MWCNTs-COOH暴露后，两种酶的二级结构和构象保持相对稳定，没有观察到明显的变构或构象变化。这表明MWCNTs-COOH与酶的相互作用不足以诱导显著的结构重排，从而避免了对酶天然构象的破坏。

酶活性实验的数据显示，MWCNTs-COOH的存在并未显著抑制两种酶的催化活性。在一系列浓度和时间点的实验条件下，酶的动力学参数（如Km和Vmax）保持相对稳定，这进一步证实了MWCNTs-COOH对酶生理功能的中性影响。这些发现对于理解MWCNTs-COOH在生物环境中的行为及其可能的生物相容性具有重要意义，同时为评估纳米材料对生物分子潜在影响提供了实验证据。然而，这种弱相互作用可能在更复杂的生物系统中产生不同的结果，因此需要在更广泛的生物背景下进一步研究。

3.3 MWCNTs-COOH对细胞活力的影响

Muse智能触控细胞分析仪的实验详细揭示了MWCNTs-COOH对细胞活力的复杂影响机制，这种影响表现出明显的剂量-效应和时间-效应关系。在不同浓度的MWCNTs-COOH作用下，细胞活力呈现出显著的下降趋势，暗示着随着纳米材料的浓度增加，细胞功能可能受到更大的抑制。这种抑制作用可能是由于MWCNTs-COOH与细胞膜的相互作用，导致膜结构的破坏，从而影响细胞的正常生理活动。

细胞活力降低的过程与暴露时间的延长紧密相关。在较短的接触时间内，细胞可能能够部分抵御MWCNTs-COOH的毒性效应，但随着暴露时间的增加，细胞防御机制可能逐渐耗尽，最终导致细胞活力的持续下降。这种时间依赖性的毒性效应可能与MWCNTs-COOH在细胞内的积累和毒性物质的释放速率有关。

进一步的细胞形态学观察显示，MWCNTs-COOH可能导致细胞形态发生改变，如细胞收缩、膜泡形成以及细胞间连接的破坏。这些变化可能影响细胞间的通讯，进而干扰细胞的增殖和功能。MWCNTs-COOH可能通过引发内质网应激和线粒体功能障碍，促进细胞凋亡的进程，从而降低细胞活力。

在细胞代谢层面，MWCNTs-COOH可能干扰关键能量代谢途径，如糖酵解和氧化磷酸化，导致能量供应减少。纳米材料可能影响细胞内离子平衡，如钙离子稳态的破坏，进一步加剧细胞活力的损失。

综上所述，MWCNTs-COOH对细胞活力的影响是一个多层面、多途径的过程，涉及细胞结构、功能和代谢的多个方面。这些发现为理解纳米材料的生物相容性和毒性效应提供了重要信息，同时也提示在设计和使用MWCNTs-COOH时需要充分考虑其潜在的生物影响，以降低对生物系统的不良影响。

3.4 MWCNTs-COOH对氧化应激相关酶活性的影响

MWCNTs-COOH暴露导致细胞内的抗氧化防御系统遭受挑战，具体表现为CAT（过氧化氢酶）和SOD（超氧化物歧化酶）活性的显著降低。CAT与SOD作为细胞内主要的抗氧化酶，通常协同作用以清除自由基，维持氧化还原平衡。CAT的抑制意味着细胞内过氧化氢的清除能力下降，可能使过氧化氢积累，进而增加氧化应激水平。SOD活性的降低意味着超氧阴离子的转化效率减弱，可能导致更多有害的活性氧（ROS）的产生。这种抗氧化酶活性的抑制揭示了MWCNTs-COOH可能通过干扰细胞内抗氧化防御机制来诱导氧化应激。

然而，MDA（丙二醛）含量的变化无显著差异，暗示MWCNTs-COOH对细胞的脂质过氧化影响有限。MDA是脂质过氧化的标志物，其含量的增加通常与细胞损伤相关。MDA水平的稳定可能表明，尽管MWCNTs-COOH引发了氧化应激，但细胞可能通过上调其他抗氧化机制或限制ROS的进一步损害来维持基本的抗氧化防御。这一发现提示，MWCNTs-COOH对细胞的氧化应激反应并非直接导致显著的细胞损伤，而是可能在细胞抗氧化防御系统的边缘试探，激发细胞的适应性响应。

这种微妙的氧化应激反应可能具有双重性。一方面，短暂的氧化应激刺激可以激发细胞的抗氧化防御机制，如上调抗氧化基因表达，提高抗氧化酶的合成，以对抗MWCNTs-COOH的毒性影响。另一方面，长期或过度的氧化应激可能导致细胞功能障碍，甚至凋亡。因此，对MWCNTs-COOH暴露的细胞，氧化应激的动态平衡至关重要，过度或不足都可能导致不良后果。

在深入探究MWCNTs-COOH对氧化应激相关酶活性的影响时，还需要考虑细胞类型、暴露浓度、暴露时间以及MWCNTs-COOH的物理化学特性等因素。不同的细胞可能对氧化应激有不同的敏感性，而MWCNTs-COOH的表面改性、长度、直径等特性可能影响其与细胞的相互作用，进而影响氧化应激的诱导程度。这些因素的综合分析将有助于更全面地理解MWCNTs-COOH对细胞氧化应激反应的影响机制。

四、结论

研究发现，MWCNTs-COOH诱导的氧化应激反应主要表现为谷胱甘肽(GSH)水平的降低和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的增加，以及抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性的改变。这些变化揭示了MWCNTs-COOH暴露可能导致细胞内氧化还原状态失衡，进而启动细胞的抗氧化防御系统。细胞对MWCNTs-COOH的响应并非一味的损伤，可能也存在一种适应性机制，以维持细胞的基本功能。

进一步的分析发现，MWCNTs-COOH可能通过直接或间接途径影响细胞内ROS生成，例如通过干扰线粒体功能或引发内源性ROS产生。此外，MWCNTs-COOH的物理特性，如尺寸、形状和表面化学性质，可能影响其与细胞膜的相互作用，从而影响ROS的产生和细胞的氧化应激反应。

考虑到细胞类型的差异，不同类型的细胞可能对MWCNTs-COOH暴露产生的氧化应激有不同的耐受性。例如，某些细胞可能通过上调Nrf2抗氧化通路来抵抗氧化应激，而其他细胞可能依赖于不同的适应性策略。这表明，MWCNTs-COOH诱导的氧化应激反应是多因素、多层次的生物学过程。

在体内环境中，MWCNTs-COOH的分布、代谢和清除将对氧化应激反应产生复杂影响。其在生物体内的积累和生物转化可能改变其毒性特征，导致不同的细胞和组织受到不同程度的氧化损伤。因此，未来的研究应关注MWCNTs-COOH在复杂生物系统中的行为，以及其与生物分子（如蛋白质、脂质和核酸）的相互作用，以全面理解其潜在的生物毒性机制。

参考文献

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