课题名称：邯郸市科学技术研究与发展计划项目（21422083122）

Early predictive value of VEGF and AQP1 expression in retinal tissue for secondary macular edema after central central retinal vein occlusion

Handan Central Hospital ophthalmology  056001

Huo nan  Zhao junbo

Abstract: Objective To explore the early predictive value of vascular endothelial growth factor (VEGF) and aquaporin 1 (AQP1) expression in retinal tissue for macular edema after central retinal vein occlusion. Methods 220 patients (220 eyes) with CRVO treated by intravitreal injection in our hospital from April 2019 to April 2021 were selected. The patients were followed up for 6 months to observe whether they had macular edema, including 120 patients with secondary macular edema (secondary group) and 100 patients without secondary macular edema (non secondary group).. Compare the general data and the levels of VEGF and AQP1 in aqueous humor between the two groups, compare the levels of VEGF and AQP1 in macular edema of different severity, analyze the factors affecting the secondary macular edema of CRVO, analyze the predictive value of VEGF and AQP1 alone and in combination for the secondary macular edema of CRVO, and draw the ROC curve. Result The levels of tumor necrosis factor-α, interleukin-6 and VEGF in the secondary group were higher than those in the non secondary group, and AQP1 was lower than that in the non secondary group(P<0.05); There is a small amount of tumor necrosis factor in the high reflection points (HRDs) in the upper retina α、 The levels of IL-6 and VEGF were lower than those in the middle and large groups (P<0.05), and the levels of AQP1 with a small amount of HRDs were higher than those in the middle and large groups (P<0.05); Logistic regression analysis showed that tumor necrosis factor α、 The levels of interleukin-6, VEGF and AQP1 were independent risk factors for macular edema secondary to CRVO (P<0.05); The AUC value of combined detection of VEGF and AQP1 in predicting macular edema secondary to CRVO was higher than that of single detection (P<0.05). Conclusion VEGF was highly expressed in patients with CRVO secondary macular edema, and AQP1 was low expressed, which was closely related to the severity of macular edema. The combined detection of VEGF and AQP1 had high value in predicting after central CRVO secondary macular edema.

Key word Central retinal vein occlusion; Macular edema; Vascular endothelial growth factor; Aquaporin 1; Predictive value

视网膜静脉阻塞（retinal vein occlusion，RVO）是眼科常见视网膜血管性病变，按照静脉阻塞发生部位的不同分为中央静脉阻塞（central retinal vein occlusion，CRVO）、半侧静脉阻塞和分支静脉阻塞，其中CRVO是RVO最严重类型^[1]。视网膜水肿、出血、经脉迂曲扩张均是CRVO的主要特征表现，CRVO多会并发黄斑水肿，降低患者视力水平，影响日常生活^[2。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种应对缺血缺氧的应激分子，其在CRVO发生发展过程中起着重要作用^[4]。水通道蛋白1（aquaporin，AQP1）是一类形成所有生命形式的细胞屏障中膜转移通道的蛋白质，其蛋白功能损伤与视网膜血管性疾病疾病有关^[5]。目前临床上关于二者对CRVO继发黄斑水肿的预测价值研究鲜有报道。本研究旨在探讨VEGF、AQP1表达对CRVO术后患者继发黄斑水肿的早期预测价值，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取我院2019年4月至2021年4月收治的220例（220眼）行玻璃体腔内注射治疗的CRVO患者，其中男120例，女100例，年龄30~70岁，平均（50.22±7.12）岁；体重指数16~26 kg/m²，平均（22.35±2.25）kg/m²；病程7 d~13个月，平均（7.12±1.12）个月。纳入标准：（1）符合2019年《EURETINA视网膜静脉阻塞诊疗指南》解读^[6]中的相关诊断标准；（2）经眼底彩超、病史、眼底荧光血管造影检查明确诊断；（3）光学相干断层检查证实存在明确的黄斑水肿；（4）患眼最佳矫正视力在0.5以下。排除标准：（1）眼部条件不适合进行眼底荧光血管造影、光学相干断层检查者；（2）近期接受了可能影响检测结果的药物或治疗者；（3）妊娠期、哺乳期女性；（4）眼部活动性炎症者；（5）具有高眼压者；（6）合并新生血管性疾病、青光眼等其他眼部疾病；（7）合并糖尿病者。本研究经医院伦理委员会批准，患者及家属均知情同意本项研究。

1.2 方法

手术治疗：行玻璃体腔内注射抗VEGF药物，患者取仰卧位，于表面麻醉后清洁消毒，开睑器开睑，聚维酮碘灭菌30 s后使用生理盐水冲洗结膜囊，后使用30号注射器针头，距离角巩膜处4 mm进针颞下方，注射雷珠单抗0.05 mL/0.5 mg。操作完毕后结膜囊内涂抹妥布霉素地塞米松眼膏，纱布包扎。术后随访6个月观察患者是否出现黄斑水肿，CRVO继发黄斑水肿的标准^[6]：视网膜血液瘀滞、静脉迂曲扩张、视网膜水肿和出血。其中继发黄斑水肿者（继发组）120例，未继发黄斑水肿者（未继发组）100例。

房水VEGF、AQP1表达检测：术后抽取患者房水100 μL，将房水转移至离心管中，置于低温环境保存，取50 μL房水移入单克隆抗体的96孔板，使用封板胶纸封住反应孔，室温育3 h，洗涤液洗板5次，在各孔中加入酶标试剂50 μL，37℃温育30 min，洗涤液洗板5次，加入50 μL四甲基联苯胺，37℃温育15 min，后加入50 μL终止液，使用酶标仪在450 nm处测定吸光度，即VEGF水平。术中取出了结膜囊在10%中性福尔马林液中固定24 h后脱水，石蜡包埋，蜡块标本切成4 μm厚，贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，脱蜡、入水，柠檬酸缓冲液高温高压修复抗原，PBS冲洗5 min共3次。滴加50 μL10%兔抗羊血清，37℃温育10 min，吸水纸吸去多余液体，每张切片滴加稀释的一抗50 μL，37℃温育1 h，PBS冲洗5 min共3次。滴加生物素标记的二抗和100 μL新鲜配制的二氨基联苯胺显色溶液，显微镜下观察，控制显色时间。自来水冲洗，苏木精复染，脱水封片，显微镜下观察拍照。A：细胞不显色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；B：显色细胞数1/3以下为1分，1/3~2/3为2分，2/3以上为3分。积分数=A*B，A*B=1~4为弱阳性，A*B>4为强阳性，A*B=0为阴性。另使用酶联免疫吸附法检测房水肿瘤坏死因子α、白介素-6水平。

光学相干断层扫描检查：使用光学相干断层技术线性扫描黄斑中心凹的水平和垂直方向，调整入射激光的位置，直至屏幕图像清晰，移动扫描线使其经过黄斑中心凹，测定黄斑中心凹内界膜到视网膜色素上皮层和基底膜间的距离，此为黄斑中心视网膜厚度。光学相干断层上视网膜内高反射点（HRDs）的计数通过黄斑中心凹的水平方向单线性扫描图像，选取黄斑中心凹1000 μm范围内的HRDs人工计数，计数范围<50个定性为少量，50~100个定性为中等量，>100个定性为大量。

1.3观察指标

比较两组患者一般资料及房水VEGF、AQP1水平，比较不同严重程度黄斑水肿VEGF、AQP1水平，分析影响CRVO继发黄斑水肿的因素，分析VEGF、AQP1单独及联合检测对CRVO继发黄斑水肿的预测价值并绘制ROC曲线。

1.4 统计学方法

数据录入SPSS 22.0软件中分析，用[例(%)]表示计数资料，行χ²检验，用（）表示计量资料，行t检验，Logistic回归分析影响CRVO继发黄斑水肿的因素，受试者工作特征（ROC）曲线分析VEGF、AQP1单独及联合检测的敏感度和特异度，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者一般资料及房水VEGF、AQP1水平比较 未继发组与继发组性别、年龄、体重指数、病程、高血压史、高血脂史、眼压、血压、血糖水平、手术时间、住院时间差异无统计学意义（P>0.05），继发组肿瘤坏死因子α、白介素-6、VEGF水平高于未继发组，AQP1低于未继发组（P<0.05），见表1。

表1 两组患者一般资料及房水VEGF、AQP1水平比较（）

2.2 HRDs检查结果 光学相干断层扫描显示，120例CRVO继发黄斑水肿患者中HRDs数量等级少者40例，中等量者50例，大量者30例。

2.3 不同严重程度黄斑水肿VEGF、AQP1水平比较 存在少量HRDs的肿瘤坏死因子α、白介素-6、VEGF水平低于中等量者和大量者（P<0.05），存在少量HRDs的AQP1水平高于中等量者和大量者（P<0.05），见表2。

表2 不同严重程度黄斑水肿VEGF、AQP1水平比较（）

2.4 影响CRVO继发黄斑水肿的因素 Logistic回归分析结果显示，肿瘤坏死因子α、白介素-6、VEGF、AQP1是CRVO继发黄斑水肿的独立危险因素（P<0.05），见表3。

表3 影响CRVO继发黄斑水肿的因素

2.5 VEGF、AQP1单独及联合检测对CRVO继发黄斑水肿的预测价值 肿瘤坏死因子α、白介素-6、VEGF、AQP1联合检测预测CRVO继发黄斑水肿的AUC值高于单项检测（P<0.05），见表4，图1。

表4 VEGF、AQP1单独及联合检测对CRVO继发黄斑水肿的预测价值[例(%)]

注：与联合检测比较，^*P<0.05。

图1 肿瘤坏死因子α、白介素-6、VEGF、AQP1预测CRVO继发黄斑水肿的ROC曲线

3 讨论

CRVO在临床早期表现为后极部全视网膜静脉迂曲扩张，后期表现为视网膜毛细血管无灌注区形成和扩大。黄斑水肿是造成CRVO视力下降主要原因，RVO发生后，静脉血液回流受阻汇聚在黄斑区引起黄斑水肿，同时RVO发生后视网膜组织供血出现障碍，视网膜组织缺血缺氧导致VEGF水平和炎性细胞因子水平升高，增加视网膜血管通透性，进而加重黄斑水肿^[7]。目前关于CRVO继发黄斑水肿的治疗主要是玻璃体腔内注射曲安奈德、抗VEGF药物等，但曲安奈德会随着体内药物浓度的减少，对疾病的治疗不彻底，引起多种不良反应^[8-9]。抗VEGF药物疗效较好，但VEGF在CRVO继发黄斑水肿中的意义有待进一步研究。

本研究结果显示，继发组VEGF水平高于未继发组，随着CRVO患者黄斑水肿的加重，VEGF水平升高，进一步Logistic回归分析发现，VEGF是CRVO继发黄斑水肿的独立危险因素，表明VEGF在CRVO继发黄斑水肿患者中呈高表达，其与患者黄斑水肿严重程度密切相关，张荟颖等^[10]研究结果与本研究结果一致。主要原因为VEGF在正常眼部视网膜内皮细胞及周围细胞中的表达均较低，而在缺氧状态时，视网膜细胞会产生大量VEGF，增加血管通透性，升高眼内压，进而会造成黄斑水肿^[11]。目前VEGF被认为是CRVO继发黄斑水肿发生较密切细胞因子，具有增高血管通透性、改变细胞周围环境以及血管内皮细胞增殖等效果^[12]。房水VEGF在黄斑水肿患者中呈高表达的原因主要为眼局部分泌增多，视网膜内血管内皮细胞、小胶质细胞等分泌VEGF，经玻璃体腔弥散入前房^[13]。VEGF可通过增加血管通透性引起黄斑水肿，基于此，目前抗VEGF治疗已成为治疗黄斑水肿的重要方法。有研究显示，CRVO患者玻璃体腔和房水中的VEGF水平升高，其可能破坏了血-视网膜屏障^[14-15]。本研究中，观察组肿瘤坏死因子α、白介素-6高于对照组，存在少量HRDs的肿瘤坏死因子α、白介素-6、VEGF水平低于中等量者和大量者，提示肿瘤坏死因子α、白介素-6在疾病的发生发展过程中具有促进作用。肿瘤坏死因子α由活化的巨噬细胞和单核细胞产生，损伤血管及组织，促使眼部炎症反应，产生VEGF，引起血管增多^[16]。白介素-6作为炎性因子的代表，对加速炎症反应起着关键作用，肥大细胞和巨噬细胞等在机体缺氧缺血状态下会刺激内皮细胞释放白介素-6^[17]。

本研究结果显示，继发组AQP1低于未继发组，随着CRVO患者黄斑水肿的加重，AQP1水平降低，进一步Logistic回归分析发现，AQP1是CRVO继发黄斑水肿的独立危险因素，表明AQP1参与CRVO继发黄斑水肿的病理过程。AQP1通常表达在视网膜色素层细胞、外层视网膜光感受器等星形胶质细胞和Muller细胞。CRVO的发展过程与水通道蛋白一系列复杂的表达有关^[18]。研究认为CRVO与视网膜中AQP1及视网膜色素上皮中的AQP5、AQP9、AQP12等降低有关^[19]。短暂缺血缺氧状态下，AQP1免疫活性在视网膜神经胶质细胞中降低。CRVO继发黄斑水肿发病过程中关键步骤是新生血管形成，新生血管形成需要内皮细胞增殖和转移，AQP1在新生血管形成阶段起重要作用，证实AQP1参与CRVO继发黄斑水肿发展过程。有学者认为CRVO患者高渗状态使AQP1表达降低，进而通过渗透调控转录因子诱导内皮细胞中环氧酶表达，从而认为降低AQP1水平、改善高渗状态是CRVO继发黄斑水肿治疗的新方向^[20]。本研究结果还显示，肿瘤坏死因子α、白介素-6、VEGF、AQP1联合检测预测CRVO继发黄斑水肿的AUC值高于单项检测，表明上述指标联合检测对CRVO术后继发黄斑水肿的预测价值较高，其可能成为CRVO术后继发黄斑水肿的治疗靶点。本研究样本量较少，研究时间较短，研究结果难免存在一定偏倚。

综上，VEGF在CRVO继发黄斑水肿患者中呈高表达，AQP1呈低表达，其与患者黄斑水肿严重程度密切相关，二者联合检测预测CRVO术后继发黄斑水肿的价值较高。

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