引言

益生菌是对宿主健康有益的活性微生物，双歧杆菌是其中一种肠道益生菌。双歧杆菌通过发酵利用营养物质产生多种有益代谢产物，这些有益代谢产物的生成涉及一系列复杂的酶和底物的代谢途径，对宿主健康具有积极的影响^[1]。研究表明双歧杆菌能够改善葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎小鼠的相关临床症状，显著降低促炎细胞因子含量，有效调节肠道菌群^[2]。可通过调节胃肠调节肽和肠道菌群缓解小鼠便秘^[3]，也可调节肠神经-免疫互作缓解ERβ下调引起的便秘^[4]。

连翘为临床常用的中药，其味燥苦，性微寒，具有清热解毒^[5]，消肿散结、抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌等多种药理作用，安全性较高。

目前，已有研究报道连翘对湿热证有治疗作用，能够治疗炎症，改善舌和小肠组织病变，降低肠道致病菌的含量并且对肠道菌群结构有调节作用^[6]。连翘与其他中草药配伍可治疗仔猪大肠杆菌性腹泻^[7]。

本次试验旨在探究连翘提取物对小鼠肠道内的双岐杆菌是否有影响。通过灌胃不同浓度的连翘提取物，收集粪便，进行双歧杆菌的培养。

1 材料与方法

1.1材料

连翘提取物,30只雌性6周龄ICR小鼠,双歧杆菌琼脂平板，Kovacs氏靛基质试验试剂，明胶生化鉴定管。

1.2方法

（1）受试药物的配制

连翘提取物实验高浓度组，实验低浓度组：分别称取受试物 0.3g、0.15g 置于烧杯中，加蒸馏水定容至10 mL刻度，玻璃棒充分搅拌，浓度分别为0.03 g/mL、0.015 g/mL的溶液。

（2）动物分组及处理

将30只雌性ICR小鼠依据体重相近的原则，通过随机数字生成器分为三组，每组10只，分别为对照组(Control)、实验高浓度组(HFLT)、实验低浓度组(LFLT)，并记录初始体重数据。对照组采用生理盐水进行灌胃，持续两周；实验高浓度组和实验低浓度组则分别接受不同用量的连翘提取物（高浓度组0.03g/mL，低浓度组0.015g/mL）进行灌胃，同样持续两周。

（3）样品采集步骤

灌胃两周后，对所有实验小鼠再次进行称重，记录体重数据，同时密切观察小鼠的精神状态、食欲等生理指标。随后，采用颈椎脱臼法处死小鼠，确保在无菌条件下进行解剖，以收集肠道中的粪便样本。对每个样本进行编号，并记录收集时间。

（4）菌株分离

按照比例（25.0g样品加+225.0mL生理盐水），取1g粪便样品与9mL稀释液混合，标记10^-1稀释度。用500uL微量移液器逐步稀释至10^-10稀释度，每次混匀。选三个稀释度，各取1.0mL涂布双歧杆菌琼脂平板培养。设空白对照监测污染。无氧、37℃培养48小时促双歧杆菌生长。

（5）双歧杆菌的鉴别与观察

在载玻片上制作双歧杆菌标本片，显微镜下仔细观察其颜色、形态、大小等特征，根据双歧杆菌的典型特征进行鉴别，并判断是否为目标菌株。

（6）过氧化氢酶实验

取3%过氧化氢溶液0.5ml，使用微量移液器精确地滴加于待测的细菌菌落上，确保溶液均匀覆盖菌落。随后，仔细观察菌落表面是否有气泡产生。

（7）吲哚实验操作

取菌落使用Kovacs氏靛基质试验试剂进行实验。按试剂盒中说明书的规定进行操作。

（8）明胶液化反应检测

将被检菌穿刺接种于明胶生化鉴定管于20℃培养7天，逐日观察明胶液化现象。

1.3数据处理

试验所得数据均是以 Mean±SEM 来进行表示,采用Graphgrad 软件进行单因素方差分析检验(one-wayANOVA),各组数据之间的釆值可以通过用 Turkey 法来进行多重比较和检验。

2结果测定

2.1连翘提取物对小鼠临床症状及体重变化的影响。

实验过程中小鼠在灌胃前后食欲均正常，精神良好。

由表 1 可知,连翘提取物灌胃前小鼠体重无显著差异。连翘提取物灌胃后,对照组小鼠体重增加，实验高浓度组(HFLT)体重明显增加，实验低浓度组(LFLT)体重几乎不变。与对照组相比，高浓度连翘提取物灌胃促进小鼠体重增长，低浓度连翘提取物灌胃抑制小鼠体重增长。无浓度反应关系。这些结果提示:不同浓度的连翘提取物灌胃，对小鼠的影响不同。

表 1 各组试验小鼠体重比较

注：*P<0.05，与对照组比较表示差异显著；**P<0.01，表示差异极显著。

2.2双岐杆菌形态学观察

图1显微镜下菌株图片

（注:A为对照组菌株图片，B为实验高浓度组菌株图片，C为实验低

浓度组菌株图片)

对照组(Control)、实验高浓度组(HFLT)菌株为蓝紫色，根据革兰氏染色判定为革兰氏阳性菌。符合双歧杆菌特征。（图A、图B）

实验低浓度组(LFLT)菌株为红色，根据革兰氏染色判定为革兰氏阴性菌。不符合双歧杆菌特征。（图C）

2.3双歧杆菌生化指标

表 2 菌株生化鉴定结果

表2表明，对照组、实验高浓度组菌株过氧化氢酶实验、吲哚试验、明胶液化实验均为阴性，符合双歧杆菌生化鉴定结果。但是实验低浓度组过氧化氢酶实验、吲哚试验为阳性，明胶液化实验为阴性，不符合双歧杆菌生化鉴定结果。

2.4双歧杆菌的计数

表3不同稀释度的菌落数（CFU/ml）

由表3所示，相较于对照组而言，实验中的高浓度组菌落数更高，表明高浓度的处理对双歧杆菌的生长具有促进作用。相反，实验低浓度组的菌落数则低于对照组，显示出低浓度处理在某种程度上抑制了双歧杆菌的生长。

3.讨论

本研究旨在探讨连翘提取物对小鼠肠道内双歧杆菌数量的影响，并发现使用不同浓度的连翘提取物灌胃后，小鼠肠道内双歧杆菌的数量呈现出截然不同的变化趋势。具体而言，高浓度的连翘提取物灌胃导致小鼠肠道内的双歧杆菌数量显著增加，而低浓度的连翘提取物则导致双歧杆菌数量减少。这一发现揭示了连翘提取物浓度与肠道微生物之间复杂的相互作用关系。

对于高浓度连翘提取物导致双歧杆菌增多的现象，我们可以从多个角度进行探讨。首先，连翘提取物中可能含有某些能够促进双歧杆菌生长或繁殖的活性成分，这些成分在高浓度时能够充分发挥其促进作用，从而增加双歧杆菌的数量。其次，高浓度的连翘提取物可能改善了肠道环境，为双歧杆菌提供了更加适宜的生存条件，进而促进其增殖。此外，连翘提取物还可能通过调节肠道免疫功能，间接促进双歧杆菌的生长。

相比之下，低浓度连翘提取物导致双歧杆菌减少的原因则可能更为复杂。一方面，低浓度的连翘提取物可能无法提供足够的活性成分来支持双歧杆菌的生长和繁殖，或者该浓度下连翘提取物的促进效果不足以抵消其他抑制因素，最终导致了菌落数的减少。另一方面，低浓度的连翘提取物可能发挥了其抑菌抗菌作用，改变了肠道内的微生态平衡，从而抑制了双歧杆菌的生长。

参考文献：

[1]滕迎弟,王晨曦,陈一凡,等.双歧杆菌的有益代谢物生成途径及其健康作用和应用[J].食品科学,1-15[2024-07-05].http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20240523.1611.014.html.

[2]侯千暠,胡静怡,黄钻元,等.青春双歧杆菌对溃疡性结肠炎小鼠的缓解作用[J/OL].微生物学报,1-17[2024-09-08].https://doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20240402.

[3]陈智仙,彭宁,张彦.动物双歧杆菌乳亚种Bi66缓解便秘及调节肠道菌群作用[J/OL].食品工业科技,1-12[2024-09-08].https://doi.org/10.13386/j.issn1002-0306.2023090193.

[4]李嘉臻,梅春霞,黄尹,等.长双歧杆菌CCFM1240通过调节肠神经-免疫互作缓解ERβ下调引起的便秘[J/OL].食品与发酵工业,1-13[2024-09-08].https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.039787.

[5]马雪百合,郭健敏,温玉莹,等.连翘化学成分、药理作用及安全性评价的研究进展[J].中药新药与临床药理,2024,35(07):1093-1100.DOI:10.19378/j.issn.1003-9783.2024.07.018.

[6]周祎青,郑裕华,陈颂,等.连翘对岭南湿热模型小鼠的作用及其肠道菌群变化的研究[J].中药新药与临床药理,2019,30(06):678-685.DOI:10.19378/j.issn.1003-9783.2019.06.007.

[7]刘玉芹,张秀英,马得莹,等.中草药抗仔猪大肠杆菌性腹泻作用机理的研究[J].畜牧兽医学报,2005,(06):620-624.

作者简介：张蕊蕊（2003-）女，汉，山西省太原市，本科，学生，研究方向：动物医学。

基金项目：山西省 2024 年大学生创新创业训练计划项目“连翘提取物对肠道双歧杆菌的影响”（20241842）