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Study on influencing factors and optimization methods for determination of Alkali-hydrolyzed Nitrogen in red soil

QUAN Jia-le¹，LI Qiu-mao¹，ZHOU Jia-hui¹，CHENG Xiao-di^1,2*，YAN Yu-peng^1,2，ZHANG Qin^1,2

（¹College of  Land Resources and Environment, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China；²Key Laboratory of Agricultural Resources and Ecology in Poyang Lake Watershed of Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Nanchang 330045, China； ³Ganzhou Tobacco Company Shicheng Branch, Ganzhou 342700, Jiangxi）

Abstract: Alkaline hydrolyzed nitrogen content, as an effective indicator of soil nitrogen, can accurately reflect the nitrogen supply level of the soil. Studying the influencing factors of soil alkaline nitrogen determination under different conditions is of great significance for efficient and accurate determination of alkaline nitrogen. Using the typical soil of Jiangxi - Yingtan Red Soil (GBW07416) as the test material, the alkaline hydrolysis diffusion method was used to study the effects of different temperatures (35°C, 40°C, 50°C, 60°C), alkali concentrations (0.9 mol/L, 1.2 mol/L, 1.5 mol/L, 1.8 mol/L), and reaction time (3 h, 6 h, 12 h, 24 h) on the results of alkaline hydrolysis nitrogen determination, and to optimize the experimental conditions for the determination of alkaline hydrolysis nitrogen.(1) When the two variables of temperature, time, and concentration are fixed, the measured value of alkaline nitrogen will increase with the increase of temperature, time, and concentration; (2) The alkaline nitrogen content measured in the red soil of Yingtan, Jiangxi Province at 60°C, 1.8 mol/L, 6 h and 50°C, 0.9 mol/L, and 12 h is generally consistent with the alkaline nitrogen content measured at 40°C, 1.2 mol/L, and 24 h (standard conditions). By shortening the alkaline hydrolysis time, increasing the concentration of alkaline solution, and increasing the temperature of the incubator, accurate and efficient determination of alkaline hydrolysis nitrogen content can be achieved.

Key words: Alkali-hydrolyzed nitrogen; Alkalysis diffusion method; Red soil; Influencing factor

土壤碱解氮也被称为土壤有效氮，是作物氮素营养的主要来源。它包括无机的矿物态氮和部分有机质中易分解的比较简单的有机态氮，是铵态氮、硝态氮、氨基酸、酰胺和易水解蛋白质氮的总和（刘苹等，2020；侯建伟等，2021；刘华峰等，2020）。碱解氮更能反映当季或近期土壤供氮能力，其含量关系着作物产量与生长情况，与土壤全氮相比，是衡量土壤肥力的重要指标之一（毛雪梅，2020）。土壤碱解氮的测定方法一般分为碱解扩散法和碱解蒸馏法两种（栗忱，2022）。目前，农业院校多采用碱解扩散法测定土壤碱解氮（全国农业技术推广服务中心，2006）。碱解扩散法是以硼酸吸收氨，再用标准酸滴定，从而计算水解氮的含量（贺毅，2020）。温度、浓度、时间是影响碱解氮测定的主要因素（童娟等，2011），因此通过对实验结果进行比较，选择碱解扩散法的最适温度、时间和浓度，从而使得实验更为准确、高效。前人对三种影响因素是如何影响碱解氮含量的测定也有诸多研究：屈亮等（屈亮等，1995）曾报道杨陵塿土在碱浓度为1.2  mol/L时，最短的扩散时间为4.8 h，此时的扩散温度为70°C；当碱浓度提高至4  mol/L时，60°C需扩散5.2 h，70°C仅需3.2 h。张春丽（张春丽，2000）认为用扩散吸收法测定土壤碱解氮时，在60°C、6 h下的测定值与在40°C、24 h的测定值基本一致。李星等（李星等，2015）指出土壤标样河南黄潮土（GBW07413a）和四川紫色土（GBW07414a）使用空调控温30°C保温48 h和标准方法烘箱40°C保温24 h得出结果基本一致，且重现性良好。红壤作为我国南方地区重要的农业土壤资源（秦鑫，2020），其组成于前人所使用的黄潮土、塿土和紫色土等不同，故而红壤碱解氮的测定规律可能与前人测定结果有所不同。探究一种高效、快速测定碱解氮方法，以期让操作过程更加简单易行的同时，对江西地区农业生产也具有重要意义（戴域等，2020；Zhang et al，2018；Cheng et al，2018）。

1  材料与方法

1.1 试验材料

供试土壤以江西典型土壤—鹰潭红壤（GBW07416a）作为实验材料，pH值为4.71，碱解氮标准值为44，不确定度为4。

1.2 试验设计

试验以国家标准方法实验条件下测定的碱解氮值为参考组，分别探讨温度、浓度与时间等因素对土壤碱解氮测定值的影响。实验分为三因素三水平，每组样品均设置三组重复、两组空白（表1）。

表1  设置温度、碱解浓度和碱解时间的对照实验

Table 1 Set up the temperature, the concentration of alkali hydrolysis and alkali hydrolysis time of the control experiment

用酸滴定计算碱解氮的含量，多次重复平行该实验，取多次实验的平均值。将计算结果与江西鹰潭红壤标准值进行比对，分析实验数据结果。

1.3 实验原理

碱解扩散法的测定原理是土壤中易水解态氮（潜在有效氮）被氢氧化钠溶液碱解转化为氨气 ，氨气扩散后被硼酸溶液吸收，再用标准酸滴定硼酸吸收液中的氨气，由此计算土壤中碱解氮的含量。

1.4  实验方法

①称取通过2 mm土壤筛的风干土样2.00 g均匀铺在扩散皿外室；

②吸取20 g/L硼酸-指示剂溶液2 mL 置于扩散皿内室；

③在扩散皿的外室边缘涂上碱性胶液，盖上毛玻璃并旋转，使毛玻璃与皿边完全粘合；

④转开毛玻璃的的一边，使扩散皿露出一条狭缝，迅速向扩散皿外室加入不同浓度 氢氧化钠溶液10 mL，盖严毛玻璃片；

⑤用橡皮筋紧固毛玻璃，置于不同温度设定的恒温箱中，碱解扩散一定时间（设定时间）；

⑥用0.01  mol/L盐酸标准溶液，滴定内室硼酸中所吸收的氨量，由蓝色到微红色为终点，记下盐酸用量，设为V；同时做空白（除外室不称土，其他步骤一样），设空白用盐酸V₀。

碱解氮（mg·kg^-1）=

式中：V为滴定待测液消耗酸标准溶液体积，mL；V₀为滴定空白消耗酸标准溶液体积，mL；C为酸标准溶液浓度， mol/L；m为风干试样质量，g；14为氮的毫摩尔质量，mg；1000为换算成每千克kg含量。

1.5  数据处理与统计分析

试验所得数据用SPSS 2.0分析，不同处理之间用ANOVA进行单因素方差分析，采用LSD法进行各处理平均值的显著性比较（P < 0.05为差异显著），采用Origin 2018软件作图。

2   结果

2.1  温度对土壤碱解氮测定的影响

升高温度能显著提高碱解氮的测定值（图1）。当控制碱解浓度为1.2  mol/L，碱解时间为24 h时，与40℃相比，碱解氮测定值在50℃、60℃条件下分别提高26.19%与50.87%；在35℃条件下碱解氮测定值显著降低12.55%。

对实验结果进行方差分析，固定碱解浓度和时间的条件下，碱解氮测定值和碱解温度之间存在显著差异（P＜0.05），即碱解氮测定值会随着碱解温度的升高而升高。

图1  不同温度对土壤碱解氮测定值的影响

（a,b,c,d表示显著性水平为0.05时各处理的差异性）

Fig.1 Effects of different temperatures on the measured values of soil alkaline-hydrolyzed nitrogen

(a, b, c, d indicate the difference of each treatment when the significance level is 0.05)

2.2  浓度对土壤碱解氮测定的影响

提高碱解浓度可以增加碱解氮的测定值（图2）。当控制碱解温度40℃，碱解时间为24 h时，与1.2  mol/L相比，碱解氮测定值在1.5  mol/L、1.8 mol/L条件下分别提高2.60%、4.55%；在0.9  mol/L条件下碱解氮测定值降低1.95%。但是测定值变化趋势较小，说明碱解浓度对测定值的影响较低。

对实验结果进行方差分析，固定碱解温度和时间的条件下，与1.2  mol/L浓度相比，0.9  mol/L、浓度条件下土壤碱解氮测定值有显著差异（P＜0.05），而1.5  mol/L、1.8  mol/L无显著差异（P＞0.05），即碱解氮测定值会随着碱液浓度的升高而升高，但变化不显著。

图2  不同浓度对土壤碱解氮测定值的影响

（a,b,c,d表示显著性水平为0.05时各处理的差异性）

Fig.2 Effects of different concentrations on the measured values of soil alkaline-hydrolyzed nitrogen

(a, b, c, d indicate the difference of each treatment when the significance level is 0.05)

2.3  碱解时间对土壤碱解氮测定的影响

增加碱解时间可以显著提高碱解氮的测定值（图3）。当控制碱解温度40℃，碱解浓度为1.2  mol/L时，将碱解时间由24 h分别降至3 h、6 h、12 h，碱解氮测定值均低于碱解时间为24 h时的测定值。并且只有当碱解时间控制在24 h时，碱解氮测定值才在标准值范围。

对实验结果进行方差分析，固定碱解温度和碱解浓度的条件下，碱解氮测定值和碱解时间之间存在显著差异（P＜0.05），即碱解时间对土壤碱解氮测定有显著影响。

图3   不同时间对土壤碱解氮测定值的影响

（a,b,c,d表示显著性水平为0.05时各处理的差异性）

Fig3. The effect of different time on the determination value of soil alkali-hydrolyzed nitrogen

(a, b, c, d indicate the difference of each treatment when the significance level is 0.05)

2.4碱解氮测定条件的选择

2.4.1   12小时不同温度下碱解氮测定条件的选择    当控制碱解时间12 h，碱解浓度为1.2  mol/L时，改变恒温箱的温度，碱解氮含量和温度之间存在显著差异（图4）。随着温度的升高，碱解氮含量增高。当碱解温度为35°C、40°C时，碱解氮测定值均低于标准值范围；当碱解温度达到60℃时，碱解氮含量高于标准值范围；并且只有当碱解温度达到50°C ，碱解氮测定值在标准值范围。

图4  12h下浓度为1.5  mol/L时不同温度下的碱解氮测定值

（a,b,c,d表示显著性水平为0.05时各处理的差异性）

Fig.4  At 1.5  mol/L for 12 h, the measured values of available nitrogen at different temperatures

(a, b, c, d represent the differences of each treatment when the significance level is 0.05)

2.4.2    12小时不同浓度下碱解氮测定条件的选择    当控制碱解时间12 h，温度50°C时，碱解浓度和碱解氮测定值之间差异不显著（图5）。随着NaOH溶液的浓度的升高，碱解氮测定值增高。当碱的浓度为0.9 mol/L、1.2 mol/L时，碱解氮测定值在标准值范围。

图5  12h下温度为50°C时不同浓度下的碱解氮测定值

（a,b,c,d表示显著性水平为0.05时各处理的差异性）

Fig.5  The measured values of available nitrogen at 50°C at 12 h

(a, b, c, d indicate the difference of each treatment when the significance level is 0.05)

2.4.3     6小时不同温度下碱解氮测定条件的选择     当控制碱解时间6 h，碱解浓度1.2  mol/L时，改变恒温箱的温度，碱解氮的测定值和各温度之间存在显著差异（图6）。随着温度的升高，碱解氮测定值增高。当碱解温度为35°C、40°C、50°C时，碱解氮测定值均低于标准值范围；当碱解温度达到60°C时，碱解氮含量高于标准值范围。

图6  6h下浓度为1.5  mol/L时不同温度下的碱解氮的测定值

（a,b,c,d表示显著性水平为0.05时各处理的差异性）

Fig.6  Determination of alkali-hydrolyzed nitrogen at different temperatures at 1.5  mol/L at 6 h

(a,b,c,d denote the difference of each treatment when the significance level is 0.05)

2.4.4     6小时不同浓度下碱解氮测定条件的选择     当控制碱解时间6 h，碱解温度60°C时，改变碱解浓度，碱解氮测定值与碱解浓度之间存在显著差异（图7）。随着碱解浓度的升高，碱解氮测定值升高。该条件下碱解浓度分别为1.2  mol/L、 1.5  mol/L和1.8 mol/L时，碱解氮测定值均高于标准值范围；当碱解浓度为0.9 mol/L时，碱解氮测定值在标准值范围。

图7   6h下温度为60°C时不同浓度下的碱解氮的测定值

（a,b,c,d表示显著性水平为0.05时各处理的差异性）

Fig.7 The measured values of available nitrogen at 60 °C at 6 h

(a,b,c,d indicate the difference of each treatment when the significance level is 0.05)

2.5  快速测定土壤碱解氮条件的优化

 通过对碱解氮不同测定条件的选择，采用60°C、1.8  mol/L、6 h和50°C、0.9 mol/L、12 h为优化后条件，采用碱解扩散法优化前后的方法对标准土样进行土壤碱解氮的重复性测定（n=4），并计算相对标准偏差。优化后土壤碱解氮结果准确可靠（表2），测定结果平均值均与标准土样含量相吻合，且重现性好，相对标准偏差RSD均小于优化前的RSD。

表2   碱解扩散法优化前后对比分析

Table 2  Comparative analysis before and after alkali hydrolysis diffusion method optimization

3  分析

3.1  碱解温度对碱解氮测定的影响

本研究结果表明，碱解氮的测定值会随着碱解温度的升高而显著增加，这与李娜等（李娜等，2021 ）研究结果相似，这可能是因为：随着碱解温度提升，氢氧化钠溶液与土壤反应生成的氨气比例不断提高，而碱解氮包括铵态氮，因而碱解氮的含量提高（丁美婷等，2017）     

3.2  碱解浓度对碱解氮测定的影响

本研究结果表明，碱解氮的测定值会随着碱解浓度的升高而显著增加，这与常江（常江，1993）结果一致，这可能是由于NaOH溶液可以使NH₄⁺与OH^﹣反应变成NH₃·H₂O，随着NaOH溶液浓度的提高，吸收固定的铵态氮含量越高，当溶液达到饱和后分解放出氨气。提高碱解浓度可以降低氨气的溶解度，使铵态氮含量增加进而提高碱解氮的浓度（冯敏铃等，2022）。

3.3  碱解时间对碱解氮测定的影响

本研究结果表明，碱解氮的测定值会随着碱解时间的增加而显著提高，与常江（常江，1993）结果一致，原因可能是由于本实验的其它三个碱解时间均低于国家标准方法要求的碱解时间24 h，故而碱解时间不够，造成反应过程不完全，实验结果偏低。

3.4  碱解氮测定的更优条件

本研究结果表明，当碱解浓度不变，碱解时间缩短为6 h和12 h，需要通过提高恒温箱温度使碱解氮测定值达到标准值，这可能是由于碱解不充分导致碱解氮含量偏低，而此时需要通过升温的方式增加反应活性，提高反应速率，使碱解氮含量在较短的时间内，达到标准范围。

当碱解温度不变时，碱解时间缩短为6 h和12 h，而，需要通过提高碱解浓度使碱解氮测定值达到标准值，这可能是由于时间短、碱解不充分导致碱解氮含量偏低，而此时需要通过增加NaOH溶液的浓度，固定更多的铵态氮，使碱解氮含量在较短的时间内，达到标准值范围。

值得注意的是，当碱解时间缩短为12 h时，升高碱解温度且增加NaOH溶液的浓度，碱解氮测定值超过标准范围，因此需要适当的降低恒温箱温度或碱的浓度，使碱解氮含量在标准范围之内；当碱解时间缩短到6 h时，升高碱解温度且增加NaOH溶液的浓度，碱解氮测定值与标准方法（40°C、1.5  mol/L、24 h）条件下几乎一致。因此，为了保证日常分析碱解氮结果具有可比性，应严格控制恒温箱的温度、碱解浓度、碱解时间，以便准确测定碱解氮（谭飞等，2022）。

4  结论

碱解的温度、浓度、时间均会对碱解氮测定值产生不同程度影响，即随着碱解的温度、浓度、时间的提高，碱解氮测定值的也随之增加。在60°C、1.8  mol/L、6 h条件下和50℃，0.9 mol/L，12 h条件下测定的碱解氮含量与标准条件（40°C、1.2  mol/L、24 h）测定的碱解氮含量大体一致。因此在实际操作中，可以通过缩短碱解时间、提高碱溶液的浓度、提高恒温箱的温度来达到准确、高效测定碱解氮含量。

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